Чем раньше, тем лучше

Площади некогда гигантского бердского химзавода ныне розданы арендатором — здесь находятся фабрики по производству мебели и удобрений, мастерские, логистические терминалы и офисы. Среди множества построек в промзоне есть одно неприметное здание — кирпичное и трёхэтажное. У входа без крыльца с деревянной дверью висит лаконичная табличка: «SibEnzyme». Со стороны невозможно догадаться, что это — единственное в России производство уникальных ферментов, которые скоро станут основой тестов для определения рака на ранней стадии. Корреспондент Сиб.фм для спецпроекта «Технологии и инновации» побывал в компании и узнал, какие эксперименты проводят здесь над бактериями и как создают уникальные вещества, способные в будущем спасать миллионы жизней.

Инструменты в руках портного

Когда-то в Советском союзе было две лаборатории, занимавшихся такого рода ферментами, — в Кольцово и в Вильнюсе. После распада СССР осталась лишь одна. На её основе доктор биологических наук Сергей Дегтярёв и создал компанию «СибЭнзайм» — коммерческую, по сути, организацию, сотрудники которой занимались фундаментальной наукой ради интереса, а на жизнь зарабатывали, производя ферменты и продавая их в лаборатории по всему миру.

Вход в лабораторию находится рядом со столовой, в маленьком коридорчике пахнет борщом и пирожками — у сотрудников скоро обед. Но мы проходим на второй этаж, в кабинет с ретортами, микроскопами и чашками Петри, где готовятся совсем другие «блюда». Нас встречает заместитель директора по производству компании «СибЭнзайм» Данила Гончар.

— Нас интересуют те ферменты, что «узнают» ДНК, — говорит Гончар, — Если считать, что ДНК — это ткань, то наши ферменты —инструменты в руках портного. Есть инструменты, которые режут «материал» в конкретных точках, создавая определённый узор и рисунок.

Есть ферменты, которые обрабатывают концы «ткани», есть те, что сшивают, и те, которые по имеющейся матрице строят её точную копию. Вот такая «кухня».

Главная помощница — кишечная палочка E.coli. Хотя учёные исходные ферменты выделяют из самых разных микроорганизмов, палочка — самая удобная и «окультуренная» среди них. Она непривередлива к среде и быстро размножается. В неё можно внедрять нужный генетический материал и клонировать его таким образом.

— Вся клонированная биомасса передаётся на третий этаж. Там инженеры-технологи разрушают с помощью ультразвука бактериальные клетки и выделяют из них ферменты, которые нас интересуют. Получившийся растворчик — жидкий препарат фермента — передаётся на первый этаж, — рассказывает учёный, — Там аналитики проверяют фермент, который узнаёт именно ту последовательность ДНК, которая требуется. Потом мы передаём всё это в Кольцово, в отдел сбыта, откуда уже ферменты расходятся по всему миру: в США, Европу, Японию, Бразилию, Турцию, Малайзию и Индию. В том числе, их используют очень многие российские НИИ биологической направленности, и, в частности, лаборатория Центра вирусологии и биотехнологии «Вектор». Там ферменты применяют, например, для разработки новых видов диагностики.

— А какие характеристики требуются от ферментов?

— Суть в том, что вся наша ДНК состоит из четырёх «букв», это так называемый «генетический алфавит». Все четыре миллиарда пар оснований — это последовательность разных комбинаций этих букв. В ней есть участки, кодирующие белки, то есть гены — их около 3%, а всё остальное — некодирующие. Науке пока точно не известно, для чего их создала природа. Ферменты должны «узнавать» конкретную последовательность ДНК, например, содержащую эти четыре буквы.

Действие ферментов основано на их способности «узнавать» определённые участки ДНК. Существует фермент рестриктаза — «цепной пёс» в мире ферментов. Он может атаковать определённые последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. А может и не делать этого. Например, кусочек ДНК содержит метильную группу — это метка. Фермент рестриктаза видит её и не трогает этот кусочек. Если же в организм попадает чужеродная бактерия, которая такой метки в своей ДНК не содержит — рестриктаза набрасывается на неё и расщепляет на мелкие кусочки.

По сути, это примитивный аналог иммунной системы.

Новый фермент, который получили в лаборатории «СибЭнзайм», действует ровно наоборот. Нуклеотиды без метки он не трогает, а те, что содержат метильные группы — расщепляет.

— Ферменты достаточно новые, и мы уже поняли, где их применять, но пока не выяснили, для чего они изначально нужны в природе, так как «вражеские» субстратные ДНК для этих ферментов пока ещё толком не известны, — говорит Данила Гончар, — возможно, это вообще пережиток древних времён, когда бактериям зачем-то нужны были эти ферменты.

При этом найти нужные ферменты не так просто. Изначально невозможно предсказать, какие бактерии каким набором генов обладают, поэтому нужно перебрать тысячи штаммов, чтобы найти ферменты, узнающие новые уникальные последовательности нуклеотидов.

— Библиотеку микроорганизмов нужно постоянно пополнять, — рассказывает Гончар, — все эти годы мы искали их, ездили и на Алтай, и на Камчатку.

В нашей компании был разработан новый класс ферментов, которых нет сейчас ни у кого в мире.

Их у нас хочет лицензировать одна американская компания, но мы не продаём, потому что сами хотим создавать готовый продукт, а лучше — технологию. Мы, конечно, сотрудничаем, публикации делаем совместные, но право распоряжаться продуктом интеллектуального труда — у нас.

На получение фермента обычно требуется год-полтора. Но, как рассказывает Данила Гончар, некоторые ферменты были найдены ещё в 2005 году, охарактеризованы в 2008-2010 годах, и только сейчас, к 2015 году, стало понятно, для каких диагностических целей их можно использовать. То есть прошло около 10 лет.

Биолог показывает мне чашку Петри — в ней бактерии разделены на несколько групп и размещены строчками, словно слова на миниатюрной книжной странице. Внешне все колонии выглядят одинаково, и понять, в чём отличие, можно, только взяв содержимое на пробу.

Чтобы разрушить бактерию, то есть пробить её клеточную стенку, используется фермент лизоцим — тот же, что содержится в слюне. Лизоцим разрушает стенки клетки, она становится как бы «дырявой» — получается вязкая суспензия с полуразрушенными клетками. Затем на них воздействуют ультразвуком. Я наблюдаю, как сотрудница ставит колбу в специальное устройство, похожее на кофе-машину, только вместо краника с кофе — стержень, из которого исходит ультразвук. Когда его включают, начинает слегка ломить зубы.

Ультразвук разрушает клеточные стенки полностью. Остаются одни «внутренности» клеток, в том числе и ДНК.

После ультразвуковой процедуры «бульон» осветляется в центрифуге и проходит хроматографическую очистку. Весь процесс — это, по сути, отделение от целевого белка-фермента всего лишнего.

ДНК содержит закодированную информацию, на основе которой клетка в специальных отделах — рибосомах — выстраивает белки для организма

После этого необходимо провести проверку получившегося фермента. К нему добавляют субстратные ДНК, выдерживают реакцию определённое время и наносят продукты реакции на гелевую пластинку. Пластинка помещается в камеру со специальной электропроводящей жидкостью, к ней подключается ток. Поскольку ДНК — отрицательно заряженная молекула, она движется от минуса к плюсу. Чем крупнее кусочек ДНК, тем он медленнее двигается, «застревает» на полпути. На снимке получается набор полосок разной степени толщины.

— Но они же все одинаково выглядят? Как светлые полосочки.

— Ну, в данном случае да. Но для каждого фермента набор полосочек разный. Ферменты определяют по количеству и расположению вот этих «заборчиков», которые сравнивают с так называемым маркером.

— Маркер содержит фрагменты известной длины, чтобы мы относительно него могли посчитать длину фрагмента. Например, вот этот толстенький фрагмент соответствует тысяче пар оснований, а этот — трем тысячам пар, — говорит Данила Гончар, показывая на полоски, — это как линейка, по которой мы можем померить длину получившихся фрагментов экспериментальных образцов. Сравнивая получившийся рисунок с эталоном, мы можем понять — это то, что мы хотели, или что-то другое. У нас есть журнал, где отмечаются результаты проверки каждой партии, какие-то огрехи, и дается диагноз: годится фермент или нужно доработать.

Когда всё в норме, материал размещают по пробиркам, на них наклеивается этикетка с основными данными, прикладывается паспорт. Потом пробирки с ферментами фасуются и замораживаются. В таком виде они и поступают потребителю, либо для диагностики. В частности, пробирки с ферментами из «СибЭнзайма» поступают в центр «Вектор» в Кольцово, где ферменты используют для исследований. Одно из перспективных направлений — разработка тестов для ранней диагностики рака. Об этом мне рассказал директор компаний «СибЭнзайм» и «ЭпиДжин» Евгений Дубинин.

Раньше всех

Когда стали понятны перспективы применения новых ферментов, технологией заинтересовался наноцентр «СИГМА.Новосибирск». Так появился стартап «ЭпиДжин» — совместная компания наноцентра и «СибЭнзайм», который сегодня вместе с научным центром «Вектор» занимается разработкой тест-системы на колоректальный рак. Еще в планах у «ЭпиДжина» — диагностика рака молочной железы, легкого и желудка. Директор компаний «СибЭнзайм» и «ЭпиДжин» Евгений Дубинин раскрыл мне суть тест-системы.

— ДНК у нас одинаковая во всех клетках: кожа, кости, органы — везде. Но тогда возникает вопрос: почему кожа — это кожа, а глаз — это глаз? Оказалось, в процессе жизнедеятельности организма подключается дополнительный механизм — надгеномный или эпигеномный. Это второй уровень информации, который содержится над ДНК.

90% точность системы диагностики рака, создаваемой «Вектором» и «ЭпиДжином»

Оказалось, что есть механизмы, которые регулируют деятельность определённых генов, отвечающих за разные функции. Так механизм метилирования просто берёт и отключает ген. У гена есть регуляторная область. Если в этом месте «повиснет» метильная группа, то ген выключается. Он перестает продуцировать РНК и как следствие — белок, — рассказывает Дубинин.

Как учёные придумали тест для сверхранней диагностики рака

На самом деле, по принципу выключения генов в организме протекают не только процессы образования рака, но и многих возрастных заболеваний и даже самого старения — определённые гены просто начинают выключаться.

— Сейчас уже доказано, что механизм образования рака, сердечных заболеваний, диабета и других подобных заболеваний связан с такими эпигенетическими изменениями. В случае рака отключается ген-онкосупрессор — в нормальном состоянии он не даёт раку развиваться. Если эти гены отключаются, то начинается процесс образования опухоли.

Как раз ферменты, которые разработал «СибЭнзайм», позволяют определять наличие в определённом месте вот этой метильной группы. По сути, ферменты позволяют находить в строго определённом месте отключённые гены, — говорит Дубинин.

синтез фермента
разработка базовой технологии



разработка тест-системы


вывод на рынок


инвестор проекта

Компания «СибЭнзайм» — не новичок в этой области. Принцип диагностики рака по отключённым генам используется в Германии и США, но там используют другой метод поиска метильных групп — бисульфитную конверсию — капризный, чувствительный к условиям химической реакции, требующий сложного оборудования и содержащий высокую вероятность ошибки.

— Наш метод обладает гораздо более высокой чувствительностью, он гораздо более простой и надежный. Он требует в 50 раз меньшего количества ДНК, и внедрить такой метод в клиническую практику гораздо проще, — считает глава «ЭпиДжин».

— Получается, человек может не болеть раком, но тест позволяет выявить, что у него отключён ген, который подавляет рак?

— Нет, смысл в том, что у человека может не быть клинических проявлений. В этом основная причина смертности: клинических проявлений нет, особенно на первой стадии, и человек не идет к врачу и не лечится, а на 3-4 стадии лечиться уже часто оказывается поздно.

Предполагается, что для прохождения теста на рак человеку нужно будет просто сдать анализ крови. Из этой крови специалист выделит ДНК, обработает её разработанным в «СибЭнзайме» ферментом, «пришьёт» специальный адаптер и проведёт ПЦР, увеличивающую концентрацию целевого ДНК в пробе. Все это происходит в одной пробирке в три последовательных шага при помощи стандартных медицинских процедур.

30 миллионов рублей требуется для завершения создания экспресс-теста на рак

После этого на компьютере получается картинка — график. Если есть сигнал, то мы видим стандартную S-образную кривую. Это значит, рак есть. Если нет — то видим ровное плато.

— Получается, что это уже разработанная готовая система? Она применяется?

— Нет, разработан сам метод детекции. А сейчас наша задача состоит в том, чтобы определить выключением каких конкретных генов-онкосупрессоров сопровождается появление определённого вида рака, потому что для каждого вида рака они свои. Именно поэтому нам удаётся отличать их друг от друга. На клеточных линиях мы показали, что с помощью нашего метода можно типировать разные виды рака, поскольку узор метилирования для разных видов рака разный. Исходя из этого, можно сказать, что метилирование вот этих генов — вот этот рак, а вот этих — другой рак, — говорит Дубинин.

В СМИ систему, создаваемую на базе «СибЭнзайма», любят называть методом сверхранней диагностики рака. Но, по словам Евгения Дубинина, в медицине такого термина нет, и формально тест нельзя так называть, хотя учёные понимают, что эпигенетические изменения происходят в самом начале образования опухоли, когда другими методами рак определить еще невозможно или проблематично. На практике он предлагает принципиально новый способ определения рака — на уровне управляющих механизмов, в то время как известный сейчас метод онкомаркеров определяет уже последствия воздействия рака.

Метод онкомаркеров позволяет выявить рак только когда опухоль уже образовалась и в крови появились белки-продукты её распада.

Тест-система от «СибЭнзайма» и «ЭпиДжина» позволит находить рак «на подлёте» — в тот момент, когда произошёл сбой в генах. Опухоли в этот момент может и не быть.

— Появление рака — это, чаще всего, реакция на внешние причины: канцерогены, курение, неправильный образ жизни. Если в здоровом организме работают нужные гены, то они защищают организм, а если не работают, то образуется рак. Они поэтому так и называются: онкосупрессоры. Супрессоры значит «подавляющие», — говорит Дубинин.

В будущем «ЭпиДжин» планирует вывести на рынок четыре системы для определения самых популярных видов рака — лёгких, желудка, груди и кишечника. В целом, сложность исследования состоит в том, чтобы найти нужные гены.

Сама тест-система, по словам Евгения Дубинина, будет очень простой и представлять собой набор реагентов и инструкцию, как ими пользоваться. Стоимость для пациента оценивается в 2000 рублей за одну процедуру, в то время как зарубежный тест стоит порядка 150 евро.

Но если с генами и ферментами учёные более-менее разобрались, то на следующем этапе встаёт другая проблема — уже социальная.

Люди не приучены проходить регулярные медицинские обследования. Если хорошо себя чувствуешь — зачем идти к врачу?

— Человек не пойдёт просто так кровь сдавать. А должна быть некоторая культура, чтобы можно было массово засекать рак, чтобы люди регулярно обследовались. У нас, к сожалению, не всегда все это делают. Это должно быть на уровне государственной политики — не для всех, но хотя бы для групп риска, — говорит директор «ЭпиДжина».

Сейчас разрабатывается первая из четырёх тест-систем — на диагностику колоректального рака. Всё идет по графику, и ожидается, что к концу следующего года тест-система будет готова. Затем понадобится ещё около года, чтобы завершить все процедуры регистрации и начать поставлять продукт в клиники.